ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ ПРИ РАЗРАБОТКЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА ПТИЦ И БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА

В настоящей работе представлены результаты оценки специфичности праймеров и зондов, разработанных для мультиплексной Real-time ПЦР тест-системы, предназначенной для диагностики гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Для проверки специфичности использовали РНК вирусов болезни Ньюкасла, гриппа птиц А типа и инфекционного бронхита кур. В качестве положительных контролей применялись сконструированные плазмидные ДНК с фрагментами генов М (вирус болезни Ньюкасла) и NP (вирус гриппа птиц), отрицательным контролем служила деионизированная вода. Оптимизированная программа амплификации включала этап обратной транскрипции, денатурации и 45 циклов ПЦР в реальном времени с регистрацией флуоресцентных сигналов.

Полученные результаты показали, что разработанные праймеры и зонды обеспечивают избирательное определение целевых геномных фрагментов вирусов при отсутствии перекрёстных реакций и ложноположительных сигналов. Дополнительно проведено сравнение с коммерческими наборами ПЦР-ГРИПП-А-ФАКТОР и ПЦР-НЬЮКАСЛА-ФАКТОР, результаты которого подтвердили достоверность и воспроизводимость данных, полученных с использованием разработанной системы.

Таким образом, разработанная тест-система характеризуется высокой специфичностью и может быть рекомендована для применения в ветеринарной диагностике.

1. Казахстанская сельскохозяйственная газета Аграрий Казахстана. Птицеводство Казахстана: состояние и проблемы развития [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://abkaz.kz/pticevodstvo-kazaxstana-sostoyanie-i-problemy-razvitiya/ (дата обращения: 25.11.2020).

2. Богоявленский А. П., Березин В. Э. Вирусные инфекции в промышленном птицеводстве и проблемы их диагностики // Биотехнология. – Секция 2.

3. Усиление подготовленности и укрепление способности к ответным действиям в случае высокопатогенного птичьего гриппа (и других зоонозных заболеваний, появляющихся заново или повторно) в странах Восточной Европы и Центральной Азии: материалы совещания, Стамбул, 29 июня – 1 июля 2009 г. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.fao.org/docs/eims/upload/267122/ak698r00.pdf

4. Горбунова А. С., Пысина Т. В. Грипп животных. – М., 1973.

5. Сюрин В. Н., Осидзе Н. Г. Грипп птиц // Малоизвестные заразные болезни животных. – М., 1973.

6. Adlhoch C., Gossner C., Koch G., Brown I., Bouwstra R., Verdonck F. et al. Comparing introduction to Europe of highly pathogenic avian influenza viruses A(H5N8) in 2014 and A(H5N1) in 2005 // Euro Surveill. – 2014. – Vol. 19, № 50. – P. 20996.

7. Control of Communicable Diseases Manual. – 20th Edition. – Washington DC: APHA Press, 2015. – ISBN 978-0-87553-018-5.

8. Li Q. et al. Epidemiology of Human Infections with Avian Influenza A(H7N9) Virus in China // New England Journal of Medicine. – 2014. – Vol. 370. – P. 520–532.

9. Fotina T. I. The role of the microbial monitoring in the prevention of poultry // Proceedings of XXV World Poultry Congress. – China, 2016. – P. 250–251.

10. Jhung M. A., Nelson D. I., Centers for Disease C., Prevention. Outbreaks of avian influenza A (H5N2), (H5N8), and (H5N1) among birds – United States, December 2014 – January 2015 // MMWR Morb Mortal Wkly Rep. – 2015. – Vol. 64, № 4. – P. 111.

11. World Organisation for Animal Health (OIE). Update on highly pathogenic avian influenza in animals (type H5 and H7), 2015–2016 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/update-on-avian-influenza/2015/

12. Geraci J. R., St. Aubin D. J., Barker I. K., Webster R. G., Hinshaw V. S., Bean W. J. et al. Mass mortality of harbor seals: pneumonia associated with influenza A virus // Science. – 1982. – Vol. 215. – P. 1129–1131.

13. CDC. Seasonal Influenza (Flu) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.cdc.gov/flu/

14. Lin Y. P., Shaw M., Gregory V., Cameron K., Lim W., Klimov A. et al. Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses: Relationship between H9N2 and H5N1 human isolates // PNAS. – 2000. – Vol. 97, № 17. – P. 9654–9658.

15. Ito T., Gorman O. T., Kawaoka Y., Bean W. J., Webster R. G. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins // Journal of Virology. – 1991. – Vol. 65, № 10. – P. 5491–5498.