biobБиобезопасность и БиотехнологияBiosafety and Biotechnology2707-72412957-5702Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности10.58318/2957-5702-2025-24-11-22biob-218Research ArticleСТАТЬИArticlesОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ ПРИ РАЗРАБОТКЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА ПТИЦ И БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛАDETERMINATION OF PRIMER AND PROBE SPECIFICITY IN THE DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX REAL-TIME PCR TEST SYSTEM FOR THE DIAGNOSIS OF AVIAN INFLUENZA AND NEWCASTLE DISEASEhttps://orcid.org/0000-0002-4701-1992БурашевЕ. Д.BurashevYe. D.

PhD, заведующий лабораторией «Мониторинг инфекционных болезней».

Гвардейский

Guardeyskiy

y.burashev@biosafety.kzhttps://orcid.org/0000-0001-6299-9399КожабергеновН. С.KozhabergenovN. S.

Магистр, заведующий лабораторией «Коллективного пользования».

Гвардейский

Guardeyskiy

kozhabergen@biosafety.kzhttps://orcid.org/0000-0003-0878-9168ӘубәкірН. А.AubakirN. A.

Магистр, младший научный сотрудник.

Гвардейский

Guardeyskiy

N.Aubakir@biosafety.kzhttps://orcid.org/0000-0003-4215-2638ОмароваЗ. Д.OmarovaZ. D.

Магистр, научный сотрудник.

Гвардейский

Guardeyskiy

Z.Omarova@biosafety.kzhttps://orcid.org/0000-0001-7741-0938ТулендибаевА. Б.TulendibayevA. B.

Магистр, научный сотрудник.

Гвардейский

Guardeyskiy

a.tulendibayev@biosafety.kzhttps://orcid.org/0000-0002-1597-7784ЕрмекбайТ. Т.YermekbaiT.

Магистр, младший научный сотрудник.

Гвардейский

Guardeyskiy

t.yermekbai@biosafety.kzhttps://orcid.org/0000-0002-5656-0678АргимбаеваТ. У.ArgimbaevaT. U.

Магистр, научный сотрудник.

Гвардейский

Guardeyskiy

T.Argimbayeva@biosafety.kzhttps://orcid.org/0000-0001-5808-9632ӘлібековаД. Ә.AlibekovaD. A.

Магистр, младший научный сотрудник.

Гвардейский

Guardeyskiy

alib3kova@gmail.comТОО «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности», Национальный холдинг «QazBioPharm»КазахстанLLP «Research Institute for Biological Safety Problems», National holding «QazBioPharm»Kazakhstan2025100420260241122Copyright © Бурашев Е.Д., Кожабергенов Н.С., Әубәкір Н.А., Омарова З.Д., Тулендибаев А.Б., Ермекбай Т.Т., Аргимбаева Т.У., Әлібекова Д.Ә., 20262026Бурашев Е.Д., Кожабергенов Н.С., Әубәкір Н.А., Омарова З.Д., Тулендибаев А.Б., Ермекбай Т.Т., Аргимбаева Т.У., Әлібекова Д.Ә.Burashev Y.D., Kozhabergenov N.S., Aubakir N.A., Omarova Z.D., Tulendibayev A.B., Yermekbai T., Argimbaeva T.U., Alibekova D.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.biosafety.kz/jour/article/view/218

В настоящей работе представлены результаты оценки специфичности праймеров и зондов, разработанных для мультиплексной Real-time ПЦР тест-системы, предназначенной для диагностики гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Для проверки специфичности использовали РНК вирусов болезни Ньюкасла, гриппа птиц А типа и инфекционного бронхита кур. В качестве положительных контролей применялись сконструированные плазмидные ДНК с фрагментами генов М (вирус болезни Ньюкасла) и NP (вирус гриппа птиц), отрицательным контролем служила деионизированная вода. Оптимизированная программа амплификации включала этап обратной транскрипции, денатурации и 45 циклов ПЦР в реальном времени с регистрацией флуоресцентных сигналов.

Полученные результаты показали, что разработанные праймеры и зонды обеспечивают избирательное определение целевых геномных фрагментов вирусов при отсутствии перекрёстных реакций и ложноположительных сигналов. Дополнительно проведено сравнение с коммерческими наборами ПЦР-ГРИПП-А-ФАКТОР и ПЦР-НЬЮКАСЛА-ФАКТОР, результаты которого подтвердили достоверность и воспроизводимость данных, полученных с использованием разработанной системы.

Таким образом, разработанная тест-система характеризуется высокой специфичностью и может быть рекомендована для применения в ветеринарной диагностике.

This study presents the results of evaluating the specificity of primers and probes developed for a multiplex real-time PCR test system designed for the detection of avian influenza and Newcastle disease. To assess specificity, RNA samples from Newcastle disease virus, avian influenza virus type A, and infectious bronchitis virus of chickens were used. As positive controls, plasmid DNAs containing fragments of the M gene (Newcastle disease virus) and NP gene (avian influenza virus) were employed, while deionized water served as a negative control. The optimized amplification program included a reverse transcription step, denaturation, and 45 cycles of real-time PCR with registration of fluorescent signals.

The results demonstrated that the developed primers and probes provided selective detection of the target genomic fragments of viruses without cross-reactions or false-positive signals. Additionally, a comparison with commercial kits PCR-GRIPP-A-FACTOR and PCR-NEWCASTLE-FACTOR confirmed the reliability and reproducibility of the obtained data.

Therefore, the developed test system is characterized by high specificity and can be recommended for practical use in veterinary diagnostics.

тест-системаПЦР Реал-Таймгрипп птицболезнь Ньюкаслачувствительностьtest systemReal-time PCRavian influenzaNewcastle diseasesensitivityДанная работа выполнена в рамках проекта грантового финансирования ИРН AP19676553 «Эпидемиологический мониторинг и разработка современных средств диагностики особо опасных вирусных болезней птиц»ReferencesКазахстанская сельскохозяйственная газета Аграрий Казахстана. Птицеводство Казахстана: состояние и проблемы развития [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://abkaz.kz/pticevodstvo-kazaxstana-sostoyanie-i-problemy-razvitiya/ (дата обращения: 25.11.2020).Kazakhstanskaya sel'skokhozyaystvennaya gazeta Agrariy Kazakhstana. Ptitsevodstvo Kazakhstana: sostoyanie i problemy razvitiya [Elektronnyy resurs]. – Rezhim dostupa: http://abkaz.kz/pticevodstvo-kazaxstana-sostoyanie-i-problemy-razvitiya/ (data obrashcheniya: 25.11.2020).Богоявленский А. П., Березин В. Э. Вирусные инфекции в промышленном птицеводстве и проблемы их диагностики // Биотехнология. – Секция 2.Bogoyavlenskiy A. P., Berezin V. E. Virusnye infektsii v promyshlennom ptitsevodstve i problemy ikh diagnostiki // Biotekhnologiya. – Sektsiya 2.Усиление подготовленности и укрепление способности к ответным действиям в случае высокопатогенного птичьего гриппа (и других зоонозных заболеваний, появляющихся заново или повторно) в странах Восточной Европы и Центральной Азии: материалы совещания, Стамбул, 29 июня – 1 июля 2009 г. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.fao.org/docs/eims/upload/267122/ak698r00.pdfUsilenie podgotovlennosti i ukreplenie sposobnosti k otvetnym deystviyam v sluchaye vysokopatogennogo ptichego grippa (i drugikh zoonoznykh zabolevaniy, poyavlyayushchikhsya zanovo ili povtorno) v stranakh Vostochnoy Yevropy i Tsentral'noy Azii: materialy soveshchaniya, Stambul, 29 iyunya – 1 iyulya 2009 g. [Elektronnyy resurs]. – Rezhim dostupa: http://www.fao.org/docs/eims/upload/267122/ak698r00.pdfГорбунова А. С., Пысина Т. В. Грипп животных. – М., 1973.Gorbunova A. S., Pysina T. V. Gripp zhivotnykh. – M., 1973.Сюрин В. Н., Осидзе Н. Г. Грипп птиц // Малоизвестные заразные болезни животных. – М., 1973.Syurin V. N., Osidze N. G. Gripp ptits // Maloizvestnye zaraznye bolezni zhivotnykh. – M., 1973.Adlhoch C., Gossner C., Koch G., Brown I., Bouwstra R., Verdonck F. et al. Comparing introduction to Europe of highly pathogenic avian influenza viruses A(H5N8) in 2014 and A(H5N1) in 2005 // Euro Surveill. – 2014. – Vol. 19, № 50. – P. 20996.Adlhoch C., Gossner C., Koch G., Brown I., Bouwstra R., Verdonck F. et al. Comparing introduction to Europe of highly pathogenic avian influenza viruses A(H5N8) in 2014 and A(H5N1) in 2005 // Euro Surveill. – 2014. – Vol. 19, № 50. – P. 20996.Control of Communicable Diseases Manual. – 20th Edition. – Washington DC: APHA Press, 2015. – ISBN 978-0-87553-018-5.Control of Communicable Diseases Manual. – 20th Edition. – Washington DC: APHA Press, 2015. – ISBN 978-0-87553-018-5.Li Q. et al. Epidemiology of Human Infections with Avian Influenza A(H7N9) Virus in China // New England Journal of Medicine. – 2014. – Vol. 370. – P. 520–532.Li Q. et al. Epidemiology of Human Infections with Avian Influenza A(H7N9) Virus in China // New England Journal of Medicine. – 2014. – Vol. 370. – P. 520–532.Fotina T. I. The role of the microbial monitoring in the prevention of poultry // Proceedings of XXV World Poultry Congress. – China, 2016. – P. 250–251.Fotina T. I. The role of the microbial monitoring in the prevention of poultry // Proceedings of XXV World Poultry Congress. – China, 2016. – P. 250–251.Jhung M. A., Nelson D. I., Centers for Disease C., Prevention. Outbreaks of avian influenza A (H5N2), (H5N8), and (H5N1) among birds – United States, December 2014 – January 2015 // MMWR Morb Mortal Wkly Rep. – 2015. – Vol. 64, № 4. – P. 111.Jhung M. A., Nelson D. I., Centers for Disease C., Prevention. Outbreaks of avian influenza A (H5N2), (H5N8), and (H5N1) among birds – United States, December 2014 – January 2015 // MMWR Morb Mortal Wkly Rep. – 2015. – Vol. 64, № 4. – P. 111.World Organisation for Animal Health (OIE). Update on highly pathogenic avian influenza in animals (type H5 and H7), 2015–2016 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/update-on-avian-influenza/2015/World Organisation for Animal Health (OIE). Update on highly pathogenic avian influenza in animals (type H5 and H7), 2015–2016 [Elektronnyy resurs]. – Rezhim dostupa: http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/update-on-avian-influenza/2015/Geraci J. R., St. Aubin D. J., Barker I. K., Webster R. G., Hinshaw V. S., Bean W. J. et al. Mass mortality of harbor seals: pneumonia associated with influenza A virus // Science. – 1982. – Vol. 215. – P. 1129–1131.Geraci J. R., St. Aubin D. J., Barker I. K., Webster R. G., Hinshaw V. S., Bean W. J. et al. Mass mortality of harbor seals: pneumonia associated with influenza A virus // Science. – 1982. – Vol. 215. – P. 1129–1131.CDC. Seasonal Influenza (Flu) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.cdc.gov/flu/CDC. Seasonal Influenza (Flu) [Elektronnyy resurs]. – Rezhim dostupa: http://www.cdc.gov/flu/Lin Y. P., Shaw M., Gregory V., Cameron K., Lim W., Klimov A. et al. Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses: Relationship between H9N2 and H5N1 human isolates // PNAS. – 2000. – Vol. 97, № 17. – P. 9654–9658.Lin Y. P., Shaw M., Gregory V., Cameron K., Lim W., Klimov A. et al. Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses: Relationship between H9N2 and H5N1 human isolates // PNAS. – 2000. – Vol. 97, № 17. – P. 9654–9658.Ito T., Gorman O. T., Kawaoka Y., Bean W. J., Webster R. G. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins // Journal of Virology. – 1991. – Vol. 65, № 10. – P. 5491–5498.Ito T., Gorman O. T., Kawaoka Y., Bean W. J., Webster R. G. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins // Journal of Virology. – 1991. – Vol. 65, № 10. – P. 5491–5498.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.