biobБиобезопасность и БиотехнологияBiosafety and Biotechnology2707-72412957-5702Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности10.58318/2957-5702-2022-12-67-73biob-40Research ArticleБИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ И БИОЗАЩИТАBIOLOGICAL SAFETY AND BIOSECURITYАПРОБАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ Aspergillus flavus МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»APPROVAL OF THE TEST-SYSTEM FOR THE INDICATION AND IDENTIFICATION OF ASPERGILLUS FLAVUS BY THE METHOD OF POLYMERASE CHAIN REACTION IN THE “REAL TIME” MODEФеоктистоваН.FeoktistovaN.feokna@yandex.ruСульдинаЕ.SuldinaE.МастиленкоА.MastilenkoA.ЛомакинА.LomakinA.ФГБОУ ВО Ульяновский государственный аграрный университет имени П.А. СтолыпинаРоссияUlyanovsk State Agrarian University named after P.A. StolypinRussian Federation2022260120231126773Copyright © Феоктистова Н., Сульдина Е., Мастиленко А., Ломакин А., 20232023Феоктистова Н., Сульдина Е., Мастиленко А., Ломакин А.Feoktistova N., Suldina E., Mastilenko A., Lomakin A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://journal.biosafety.kz/jour/article/view/40

в статье представлены результаты исследований по апробации тест-системы для индикации и идентификации микроскопических грибов Aspergillus flavus методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме «реального времени». Применяя программное обеспечение Multiple Sequence Alignment Viewer 1.22.1 и UGENA 44.0. Тест-система для A. flavus включает специфические праймеры: прямой праймер (f) 5’-3’ GGGCCCGCAGCAAGAATAC, обратный праймер (r) 3’-5’ ACGAGTTGTCACCTTCCCGAGA; флуоресцентный краситель: HEX, зонд - CGGTTCGCTTTGGTCATCGT, гаситель BHQ2. Протокол постановки реакции: предварительная денатурация – 950C - 5 минут (1 цикл); денатурация - 950C - 5 сек, отжиг - 600C - 15 сек (50 циклов). Зонд: AGCATAGGCTGATGCTCGTAGGC, флуоресцентный краситель – ROX, гаситель - BHQ-2. Чувствительность тест-системы составляет 1000 клеток. Установлена оптимальная концентрация праймеров равная 9 pМ каждого праймера на реакцию. Оптимальная концентрация зонда - 0,4 pM. Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение дихотомических ключей не позволяет максимально точно дифференцировать фитопатогенные грибы A. flavus. Новый подход к идентификации изолятов подтвердил принадлежность 15 выделенных штаммов к виду A. flavus из 20 выделенных из проб кукурузы с признаками, проявляющимися, как загнивание корней и увядание, и первично типированных как Aspergillus на основании изучения культурально-морфлогических свойств. Исследование выполнено согласно тематическому плану-заданию Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, регистрационный номер ЕГИСУ НИОКТР 122030200367-8.

the article presents the results of studies on approbation of a test system for the indication and identification of microscopic fungi Aspergillus flavus by the polymerase chain reaction method with real-time detection. Using software Multiple Sequence Alignment Viewer 1.22.1 and UGENA 44.0. The test system for A. flavus includes specific primers: forward primer (f) 5’-3’ GGGCCCGCAGCAAGAATAC, reverse primer (r) 3’-5’ ACGAGTTGTCACCTTCCCGAGA; fluorescent dye: HEX, probe - CGGTTCGCTTTGGTCATCGT, quencher BHQ2. Reaction protocol: preliminary denaturation - 95 0C - 5 minutes (1 cycle); denaturation - 95 0C - 5 sec, annealing - 60 0C - 15 sec (50 cycles). Probe: AGCATAGGCTGATGCTCGTAGGC, fluorescent dye - ROX, quencher - BHQ-2. The sensitivity of the test system is 1000 cells. The optimal concentration of primers was set equal to 9 pM of each primer per reaction. The optimal probe concentration is 0.4 pM. The results obtained indicate that the use of dichotomous keys does not allow the most accurate differentiation of phytopathogenic fungi A. flavus. A new approach to the identification of isolates confirmed the belonging of 15 isolated strains to the species A. flavus out of 20 isolated from corn samples with signs that manifest themselves as root rot and wilting, and initially typed as Aspergillus based on the study of cultural and morphological properties. The study was carried out according to the thematic plan-task of the Ministry of agriculture of the Russian Federation, the registration number of the INIS RTD 122030200367-8.

Aspergillus flavusтест-системаполимеразная цепная реакцияидентификациякукурузаиндикацияAspergillus flavustest systempolymerase chain reactionidentificationcornindicationReferencesAmaike S., Keller N. P. Aspergillus flavus // Annual review of phytopathology. – 2011. – Vol. 49. – No. 1. – P. 107-133.Amaike S., Keller N. P. Aspergillus flavus // Annual review of phytopathology. – 2011. – Vol. 49. – No. 1. – P. 107-133.Gourama H., Bullerman L. B. Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus: Aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds: A review // Journal of Food protection. – 1995. – Vol. 58. – No. 12. – P. 1395-1404.Gourama H., Bullerman L. B. Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus: Aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds: A review // Journal of Food protection. – 1995. – Vol. 58. – No. 12. – P. 1395-1404.Rudramurthy S. M. et al. Invasive aspergillosis by Aspergillus flavus: epidemiology, diagnosis, antifungal resistance, and management // Journal of Fungi. – 2019. – Vol. 5. – No. 3. – P. 55.Rudramurthy S. M. et al. Invasive aspergillosis by Aspergillus flavus: epidemiology, diagnosis, antifungal resistance, and management // Journal of Fungi. – 2019. – Vol. 5. – No. 3. – P. 55.Cho H. J. et al. Regulation of Conidiogenesis in Aspergillus flavus // Cells. – 2022. – Vol. 11. – No. 18. – P. 2796.Cho H. J. et al. Regulation of Conidiogenesis in Aspergillus flavus // Cells. – 2022. – Vol. 11. – No. 18. – P. 2796.Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. – Киев: Наукова думка, 1988. – 204 с.Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. – Киев: Наукова думка, 1988. – 204 с.Билай В.И. Основы общей микологии. – Киев, Вища школа, 1980. – 360 с.Билай В.И. Основы общей микологии. – Киев, Вища школа, 1980. – 360 с.Рябинин И.А. Разработка ключа для видовой идентификации Aspergillus spp. – возбудителей заболеваний человека, циркулирующих в Северо-Западном округе России / И.А. Рябинин, С.С. Расулова // «Профилактическая медицина-2017»: сборник научных трудов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. 6–7 декабря 2017 года. Ч. 2. – СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2017. – 312 с.Рябинин И.А. Разработка ключа для видовой идентификации Aspergillus spp. – возбудителей заболеваний человека, циркулирующих в Северо-Западном округе России / И.А. Рябинин, С.С. Расулова // «Профилактическая медицина-2017»: сборник научных трудов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. 6–7 декабря 2017 года. Ч. 2. – СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2017. – 312 с.Klich M.A. Identification of common Aspergillus species. – Utrech: Centraalbureeau voor Schimmelculture, 2002. – 116 p.Klich M.A. Identification of common Aspergillus species. – Utrech: Centraalbureeau voor Schimmelculture, 2002. – 116 p.Стахеев А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании таксономии и специфической идентификации токсинпродуцирующих грибов рода Fusarium: успехи и проблемы / А.А. Стахеев, Л.В. Самохвалова, Д.Ю. Рязанцев, С.К. Завриев // Сельскохозяйственная биология. – 2016. – Т. 51. – №3. – С. 275-284.Стахеев А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании таксономии и специфической идентификации токсинпродуцирующих грибов рода Fusarium: успехи и проблемы / А.А. Стахеев, Л.В. Самохвалова, Д.Ю. Рязанцев, С.К. Завриев // Сельскохозяйственная биология. – 2016. – Т. 51. – №3. – С. 275-284.Игнатьева С.М. Апробация мультиплексной тест-системы «HRM-Zygo-Asp» на клиническом материале больных мукормикозами / С.М. Игнатьева, В.А. Спиридонова, Т.С. Богомолова, Ю.Л. Авдеенко, Ю.В. Борзова, С.Н. Хостелиди, О.В. Шадривова, М.О. Попова, Ю.А. Чудиновских, И.С. Зюзгин, О.С. Успенская, Н.В. Васильева // Проблемы медицинской микологии. – 2019. – Т. 21. – №4. – С. 36-42.Игнатьева С.М. Апробация мультиплексной тест-системы «HRM-Zygo-Asp» на клиническом материале больных мукормикозами / С.М. Игнатьева, В.А. Спиридонова, Т.С. Богомолова, Ю.Л. Авдеенко, Ю.В. Борзова, С.Н. Хостелиди, О.В. Шадривова, М.О. Попова, Ю.А. Чудиновских, И.С. Зюзгин, О.С. Успенская, Н.В. Васильева // Проблемы медицинской микологии. – 2019. – Т. 21. – №4. – С. 36-42.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.